荧光标记糖化学衍生物试剂(氨基/炔烃/醛基/叠氮)

1．2 荧光物质8-氨基-1。3，6三磺酸芘(8-amlno-1。3。6-trisulphonic acid，ANTS) 硫酸化多糖用ANTS进行标记，方法是：将0．15 mol·L 的ANTS溶于30％ 的中，加入多糖在45't2下反应15 min后，加入氰基硼，在40℃下反应25 h，反应结束后加水稀释，溶液透析后进行冻干保存。J。Josef Chmel等人也用ANTS标记过右旋糖酐.

1．3 荧光物质N-甲基靛红酸酐(N—methylisatoic anhydride，M ) MIA标记多糖是一种快捷，温和，便利的方法，成功用于右旋糖酐和氨基半乳糖的标记，标记方法是：多糖(5—100 g·L )溶解在0．1 mol·L 的盐溶液中，pH 8，加入50％的二甲基亚砜(DMSO)，10～20 g·L 的MIA溶解在DMSO中，混匀，室温放置5～10 min后，加入上述溶液中。反应迅速，可以储存在一80％中72 h，DMSO的作用是防止DM—SO在水中不溶 J。

1．4 荧光物质5-氨基荧光素(fluoresceinamine，FLA) 一些易溶于水的多糖如果聚糖称取40 mg的量溶于2．0 mL蒸馏水中，再加入30 mg溶于350 蒸馏水的使之激活。还有一些糖如芽霉菌糖，昆布多糖，硫酸软骨素，海藻酸均需溶解在水溶液中，超声处理5 min，膜过滤后通过溶于盐缓冲液的SephdexG一50，将FLA加入到收集样品中。二次标记可增加标记效率 。

1．5 荧光物质异硫氰酸荧光素(FITC)FITC标记脂多糖的方法：将4 mg脂多糖加入2 mL的0．5％溶液中0℃搅拌20 min，使脂多糖双链解离为单链结构。用10 的1mol·L 盐酸将其PH值调节为5，然后加入含5 mg的FITC的0．1 mol·L 磷酸钠溶液1．5 mL(pH9．5)，并在37~C下搅拌孵育3 h后，在4℃下将其混合物与磷酸钠溶液彻底分离、离心后，去上清即得FITC．脂多糖 ⋯。FITC与壳聚糖连接的制备方法：在10．0 mL含1％ 壳聚糖的0．1 mol·L 乙酸溶液中，加入10．0 mL甲醇，再缓慢加入一定体积的2．0 g·L 的FITC甲醇溶液。室温暗处反应3 h后，用0．2 mol·L 沉淀标记产物” 。

从褐藻中提取出来的海洋硫酸多糖911，由于其末端不含氨基，FITC标记多糖的化学合成反应分两步：第一步：911一Tyr的合成，将400 mg 911溶于15 mL 0．2 mol·L 的磷酸钾

缓冲液(pH 8．0)，然后依次加人400 mg酪胺和150 mg，于37℃下反应96 h，间或振荡。反应完毕，离心分离，将其上清液上Sephadex G-25柱，用水洗脱收集，280 llm

检测，收集第一峰，冻干得911一Tyr。第二步：911一Tyr—F ITC合成，取200 mg 911一Tyr溶于水，用0．5 mol·L～NaHCO3调pH至8．5，然后加入25 mg F ITC，于室温、避光下反应过夜，再向反应物中加入无水乙醇至乙醇终浓度为80％ ，有大量亮黄绿色沉淀析出，离心弃去上清液。沉淀加水复溶，乙醇再沉淀，条件同上，重复3次，得911一Try—F ITC，并进一步上Sepha—dex G-25柱纯化，收集相应水洗脱组分冻干保存 。

1．6 荧光物质2·氨基吡啶(Aminopyridine，2-AP) 2-AP溶于760 ILL的12 mol·L 盐酸中，52．9 mg氰基硼溶于100 的水中。直链淀粉溶于90％ 的DMSO中，用1．8倍的水稀释。首先将100 I 的直链淀粉溶液加至1O0ILL的2一AP溶液，60℃反应1 h，再加入100 IxL的氰，进一步反应24 h，反应过后用水稀释，加入300 的1一丁醇和3 L2mol·I 氯化钠，混合物在4℃冰箱中放置1 h后直链淀粉沉淀析出 。

1．7 荧光物质氟硼荧(4，4-difluoro-5，7-dimethyl-4一bora-3a，4adiaza—S—indacene一3一propionicacid，BODIPY)BODIPY通过还原末端对聚二糖进行标记。二糖进行低压冻干，冻干后溶于含BODIPY的甲醇溶液中。将样品再次低压冻干后重新溶解在DMSO中，加入5 iLL乙酸，离心后，室温反应4 h，再加入5 的1 mol·L还原30 rain后进行低压冻干，标记过后的样品溶解在8 50％ 的DMSO中” 。