PCR技术原理、实验步骤和应用

PCR，又称聚合酶链式反应，基本原理类似于 DNA 的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR 由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成。本文详细整理了 PCR 实验原理、实验步骤、引物设计、结果分析，以及各种 PCR (RT-PCR、Realtime-PCR、QPCR)的区别、实验方法和常见问题汇总。
 
一、实验目的
1.掌握聚合酶链式反应的原理。
2. 掌握移液枪和PCR仪的基本操作技术。
 
二、实验原理
PCR技术，即聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是由美国PE Cetus公司的Kary Mullis在1983年（1993年获诺贝尔化学奖）建立的。这项技术可在试管内的经数小时反应就将特定的DNA片段扩增数百万倍，这种迅速获取大量单一核酸片段的技术在分子生物学研究中具有举足轻重的意义，极大地推动了生命科学的研究进展。它不仅是DNA分析最常用的技术，而且在DNA重组与表达、基因结构分析和功能检测中具有重要的应用价值。
PCR可以被认为是与发生在细胞内的DNA复制过程相似的技术，其结果都是以原来的DNA为模板产生新的互补DNA片段。细胞中DNA的复制是一个非常复杂的过程。参与复制的有多种因素。PCR是在试管中进行的DNA复制反应，基本原理与细胞内DNA复制相似，但反应体系相对较简单。
PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应做准备；
②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；
③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在Taq酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。
重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
 
三、实验试剂与器材
模板DNA、2.5mmol/L dNTP
Taq DNA聚合酶（5U/μL）、SSR引物
10 ×buffer、15mmol/L Mg2+、ddH2O
PCR仪、移液枪、PCR板
 
四、实验步骤
1、配制20μL反应体系，在PCR板中依次加入下列溶液：
模板DNA    2μL
引物1      1μL
引物2      1μL
dNTP      1.5μL
MgCl2        2μL
10×buffer    2μL
ddH2O      10μL
Taq酶      0.5μL
 
素材来源于网络。想了解更多生化试剂知识，敬请关注“汇百试剂”官方网站：http://www.hnhbsj.com
(本网站所有内容，凡注明来源为“汇百试剂”，版权均归汇百试剂所有，未经授权，任何媒体、网站或个人不得转载，否则将追究法律责任，授权转载时须注明“来源：汇百试剂”。本网注明来源为其他媒体的内容为转载，转载仅作观点分享，版权归原作者所有，如有侵犯版权，请及时联系我们。)