干货：支原体检测试剂盒的操作步骤及注意事项

操作步骤：
贴壁细胞
1、被检细胞接种于无菌的 6 孔细胞培养板中，接种密度为 1-2×10 4 。同时，接种正常无支原体感染的同种细胞，作为阴性对照。
2、5 天后，先吸去培养液，再加入 1ml 的固定液，静置 20min，
3、吸去固定液，晾干。
4、于每孔中，加入 1ml 的 Hoechst33258 工作液（Hoechst 33258 工作液须覆盖全部被检细胞），37℃避光放置 15-20min 或室温静置 20～30min。
5、吸去 Hoechst 33258 工作液，加入 2ml 灭菌超纯水洗涤三次，直接风干。风干后加入一滴封片液，并以盖玻片覆盖。
6、荧光显微镜观察。用紫外激发光激发，观察细胞周围是否有蓝色荧光小点或串珠状荧光小点。

悬浮细胞：
1、收集需检测的细胞，1500rpm，5min。
2、将收集的细胞涂片于载玻片上，再加 1ml 的固定液，静置 20min。
3、吸去固定液，晾干。
4、于每孔中，加入 1ml 的 Hoechst33258 工作液（Hoechst 33258 工作液须覆盖全部被检细胞），37℃避光放置 15～20min 或室温静置 20～30min。
5、吸去 Hoechst 33258 工作液，用无菌水洗涤玻片 3 次，直接风干。风干后加入一滴封固液，并以盖玻片覆盖。
6、荧光显微镜观察。用紫外激发光激发，观察细胞周围是否有蓝色荧光小点或串珠状荧光小点。
结果判断（参考）：
阴性：仅见细胞的细胞核呈现黄绿色荧光。
阳性：除细胞外，细胞周围可见大量的大小均一的荧光着色颗粒。
 
注意事项：
1．Hoechst 工作液对人体有害，请注意防护。
2．固定液有刺激性气味，建议在通风橱进行固定。
3．支原体检测时，最好用不含抗生素的培养液培养 2～3 代，这样容易避免假阴性结果。
4．本试剂盒用于 6 孔板检测时，可以进行 50 次检测反应。
5． 检测支原体污染， 可以使用支原体高效 Vero 细胞， 这样可以提高检测灵敏度， 即将被检测样品接种于 Vero细胞进行检测。

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